Tincion de gram

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gram positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto gram positivas como gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I₂ (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I₂ entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I₂/cristal violeta. Los organismos gram positivos no se decoloran, mientras que los gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células gram negativas son rojas, mientras que las gram positivas permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias gram negativas. Al término del protocolo, las gram positivas se verán azul-violáceas y las gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).

Pruebas bioquimicas

Son conjuntos o test usados para detectar alguna propiedad fisiológica o bioquímica de un microorganismo.
Las propiedades bioquímicas son las características más puntuales, evidencian la existencia de enzimas o metabolitos de las vias metabólicas, son la expresión de un gen del ADN.


Enzima: Proteinas altamente especializados encargadas de catalizar reacciones químicas.

Endoenzima: Enzimas intracelulares cuya función es catralizar reacciones tanto de síntesis como de degradación.

Exoenzimas: enzimas extracelular que son secretadas a traves de la pared celular al medio ambiente, para catalizar reacciones de degradación de macromoléculas.

Algunas otras enzimas son hidrolizantes, amilolíticas, que descomponen o hidrolizan los hidratos de carbono en forma de forma parcial o total como en la hidrolisis del almidón.

Citrato Simmons

 

Si es positivo: El medio se torna azul

Si es negativo; el medio no cambia y mantiene su color verde original

Determinación de catalasa

Agua oxigenada al 30%, se usa para determinar la presencia de catalasa. Esta presente en la mayoría de las bacterias anaerobias y aerobias.

Procedimiento.

Con el asa de siembra tomar una colonia pura de 18-24 hrs de incubación y colocar en portaobjetos.

Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H₂O₂ al 30% sobre la colonia.

Si se forman burbujas se produce O₂ y H₂O por lo que hay catalasa.

TSI

H2S + Fe2(SO4)3S -----> 2FeSO4 + H2SO4

Acido/acido/gas/ No H2S

Alcalino/Alcalino/sin gas/No H2S

Alcalino/Acido/gas/H2S

Alcalino/Acido/ Sin gas/no H2S

A=Reacción acida (color amarillo)

A/A: Fermentación de los tres azucares

K=Alcalina (Color roja/naranja)

K/A: Fermentación de glucosa

K/K=No hay fermentación ni de glucosa, lactosa ni sacarosa

Precipitado negro: H2S

Formación de burbujas: Gas

Como tomar una muestra de sangre

Las técnicas para recoger muestras de sangre son todo el tipo de procedimientos que permiten la recolección de muestras sanguíneas para el posterior análisis de la sangre en el laboratorio. Algunos de los objetivos de la recolección de muestras de sangreson el conocer elementos que normalmente se encuentran en la sangre, el determinar si hay presencia de elementos tóxicos u otras sustancias nocivas en la sangre, el vigilar y controlar el equilibrio ácido-base en la gasometría venosa y/o aislar agentes infecciosos en los estudios bacteriológicos.

Las venas del cuerpo humano que se pueden punzar para recoger las muestras de sangre son:

• Las venas superficiales del cuero cabelludo
• La yugular externa en el cuello
• La vena axilar
• Las venas basílica, cefálica y mediana en el brazo.
• Las venas radial, cubital y mediana en el antebrazo.
• Las venas dorsales de la mano.
• Las venas safena interna y externa en el tobillo.
• Las venas dorsales del pie.

 Los materiales que son requeridos para la extracción de la muestra de sangre son: Guantes desechables y estériles, palomillas con sistema de vacío, adaptador para extracción por vacío, tubos de vacío para analítica, frascos de hemocultivo, jeringa para gasometría, copos de algodón o gasas estériles, alcohol etílico de 70º, un apósito y etiquetas identificativas.                                                                            

La técnica para tomar muestras de sangre consiste en:

• Preparar los elementos necesarios
• Identificar al paciente y explicarle el procedimiento que se va a realizar. Pedirle que siente o se recueste.
• Lavar las manos de acuerdo al procedimiento establecido y colocarse los guantes
• Si es el caso, rasurar la zona
• Ubicar el compresor por encima  del sitio que se va a punzar para que la vena sea más visible.
• Localizar la vena mediante inspección. Pedirle al paciente que abra y cierre su puño.
• Desinfectar el área que se va a punzar con el algodón y el alcohol.
• Punzar la vena en dirección contraria al flujo sanguíneo. Retirar el compresor cuando la sangre empiece a brotar. Conectar el tubo de hemocultivo. Colocar la palomilla.
• Recoger la sangre
• Sacar la aguja y aplicar presión suave.
• Colocar un apósito en el sitio que fue punzado.
• Etiquetar los tubos.
• Desechar el material usado
• Lavar las manos nuevamente.
• Registrar  el procedimiento en los formatos designados.

Como sembrar una muestra

Esterilizar el anillo de asa del platino o punta de metal en su caso.

2.       Esperar a que se enfríen y tomar una muestra del medio de cultivo

3.       En el caso de la urea:

a)       flamear la boca del tubo que contiene la urea, inmediatamente sumergir el asa de platino.

b)      Agitar varias veces hasta que la muestra se haya disuelto en el medio.

c)       Rotular (ejemplo U-7C, indicando medio, equipo de trabajo y grupo)

d)      Dejar que incube durante 24-48 hrs

4.       En el caso de Klieger:    a)      Con ayuda del asa de platino, tomar una muestra.

b)      Con la técnica de estrías, pasar el asa con la muestra por toda la superficie del tubo que contiene el medio. (no tocar las paredes)

c)       Rotular

d)      Dejar incubar durante 24-48  hrs

5.       En el caso del Citrato Simmons y TSI:

a)      Con un punta de metal, previamente esterilizada, pasar por el medio dando vueltas para que quede totalmente contaminada de bacterias
b)      Picar el medio  hasta el fondo sin tocar las paredes y después estriar en la superficie
c)       Rotular 
d) Dejar en incubación durante 24-48 hrs.

      

    

    

 

Caldo de urea

Es un caldo nutritivo y diferencial

Tiene por indicador Rojo de fenol

pH final=6.8 más o menos 0.2

Aquellos que fermentan azucares como la glucosa activan la enzima ureasa

Diferencian organismos como Enterobacteriacea-Proteus-Salmonella y Shigella

Método de preparación

38.7g en 1l de agua

A 108° a 7-10 min

La incubación es en 8hrs.

·         Si da negativo a la ureasa tendrán un color durazno

·         Si da positivo a la ureasa tendrá un color buganvilia.a prueba de la ureasa constituye una de las pruebas preliminares destinada al diagnóstico diferencial de las levaduras. para la misma se utiliza el medio de agar urea de Christensen, con la desventaja de que éste es un medio costoso y de compleja elaboración.

    El propósito de este estudio fue evaluar la utilidad del caldo urea de Stuart para realizar esta prueba, el cual es un medio ampliamente usado en el área de Bacteriología, y su elaboración es sencilla.

    Para tal fin, se estudió el comportamiento de 104 cepas de levaduras pertenecientes a los géneros Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon y Saccharomyces, en ambos medios. Los resultados no mostraron diferencia alguna entre el uso de los dos medios.  

Limitaciones

Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter viran después de varios días

No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone fácilmente.

Si un microorganismo es capaz de hidrolizar la urea pero usa amoníaco como fuente de hidrogeno no produce crecimiento y da un resultado falso positivo.

Características del medio

Medio preparado: Amarillo

Almacenamiento

Medio deshidratado: A 10°-35°C

Medio preparado: 2°-8°C

AGAR EMB

El Agar Levine o Agar EMB Levine es un medio de cultivo usado para el aislamiento y diferenciación de E.coli, tiene un aspecto purpúreo, aunque naranja tras su esterilización, es semisólido, y está destinado al cultivo en placa.

Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y permite la diferenciación de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa, dando lugar a colonias incoloras, las no fermentadoras, y colonias de color azulado-negro con cierto brillo metálico, las fermentadoras.

Las colonias de E.coli sobre agar Levine miden 2-3mm de diámetro, con centros oscuros, casi negros, y pueden presentar o no cierto brillo verde metálico.

Peptona	10g
Lactosa	10g
Fosfato dipotásico	2g
Eosina	0,40g
Azul de metileno	0,065g
Agar	15g

Composición

Agar hierro klieger

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe ³⁺, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y  producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Peptona de carne	13.0	Suspender  54.8 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121°C por 15 minutos.Enfriar en pico de flauta profundo.
Cloruro de sodio	5.0
Lactosa	10.0
Tripteina	10.0
Glucosa	1.0
Citrato de hierro y amonio	0.5
Tiosulfato de sodio	0.3
Rojo de fenol	0.025
Agar	15.0
pH final: 7.3 ± 0.2

Siembra
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar el medio de cultivo, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.

Incubación
A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.

Resultados
1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.
2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares.
4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.
5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.

Microorganismo	Pico/Fondo	Producción de gas	Producción de ácido sulfhídrico
E. coli ATCC 25922	A/A	+	-
K. pneumoniae ATCC700603	A/A	+	-
P. mirabilis ATCC 43071	K/A	+	+
S. typhimurium ATCC 14028	K/A	-	+
S. enteritidis ATCC 13076	K/A	+	+
S. flexneri ATCC 12022	K/A	-	-
P. aeruginosa ATCC 27853	K/K	-	-

A: ácido

K: alcalino

Características del medio
Medio preparado: rojo


Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código:  B02-234-05	x 500g :Código:  B02-234-06