Agar

El agar o agar-agar es una gelatina vegetal de origen marino. Es un polisacáridosin ramificaciones obtenido de la pared celular de varias especies de algas de los géneros Gelidium, Euchema y Gracilaria, entre otros, resultando, según la especie, de un color característico. La palabra “agar” viene del malayo agar-agar, que significa jalea. También es conocido por los nombres “gelosa”, “gelosina”, “gelatina vegetal”, “gelatina china” o “gelatina japonesa”.

Esta gelatina ha sido utilizada desde tiempos antiguos en los países de Extremo Oriente (China, Japón, Corea, etc.) y llevada a Europa hacia la mitad del siglo XIX. En la actualidad se cultiva en muchas zonas.

Químicamente, el agar es un polímero de subunidades de galactosa; en realidad es una mezcla heterogénea de dos clases de polisacáridos: agaropectina y agarosa.¹ Aunque ambas clases de polisacáridos comparten el mismo esqueleto degalactosa, la agaropectina está modificada con grupos ácidos, tales como sulfato y piruvato. Los polisacáridos de agar sirven como la estructura primaria de la pared celular de las algas. Disuelto en agua caliente y enfriado se vuelve gelatinoso. Su uso principal es como medio de cultivo en microbiología, otros usos son como laxante, espesante para sopas, gelatinas vegetales, helados y algunos postres y como agente aclarador de la cerveza.

El agar nutritivo es usado como medio de cultivo para el crecimiento de bacterias y hongos, pero no para virus (aunque los virus bacteriófagos crecen frecuentemente en bacterias cultivadas en agar).

MEDIOS SELECTIVOS

Los medios de agar selectivos son utilizados para aplicar una presión selectiva a los organismos que crecen en ellos, por ejemplo para seleccionar solamente bacterias Gram negativas se usa el Agar McConkey, que a su vez tiene un colorante que indica si la bacteria es fermentadora de lactosa o lectos y sacarosa.

Acerca de los medios de cultivo

A continuacion queridos compañeros les compartire un enlace de un video que muestra un poco acerca de la microbiologia, espero y este sea de su agrado y descubran aspectos nuevos acerca de esto.


https://www.youtube.com/watch?v=5RfkDptrxVs

Enterobacterias

Las enterobacterias (orden Enterobacteriales y única familiaEnterobacteriaceae) son bacterias Gram negativas que contiene más de 30 géneros y más de 100 especies que pueden tener morfología de baciloso cocos. Los miembros de este grupo forman parte de la microbiota delintestino (llamados coliformes) y de otros órganos del ser humano y de otras especies animales. Algunas especies pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuáticos. Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes, incluido el cloro. Con frecuencia se encuentran especies de enterobacterias en la bio-industria: para comprobar la sanidad de la fermentación de quesos y productos lácteos, alcoholes y en tratamientos médicos,como la producción de toxinas en el uso decosméticos y fabricación de agentes antivirales de la industria farmacéutica, etc.

En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios básicos, adicional a la aparición de nuevos métodos taxonómicos para incluir a ciertos géneros que no cumplen con todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia:

• Son bacterias gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros pleomórficos.
• No son exigentes, son de fácil cultivo.
• Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa.
• Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
• Son anaeróbicos facultativos.
• Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadoresde una amplia gama de substratos en condiciones aeróbicas.
• Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no son móviles.

Adicional a ello, las enterobacterias no forman esporas, algunas producentoxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son quimioheterótrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de carbono y nitrógeno, generalmente sólo con D-glucosa, aunque algunas requieren aminoácidos y vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es de entre 22 °C y 37 °C.

Las diferencias entre los nombres de los diversos géneros provienen de criterios más precisos, como la fermentación de los diferentes azúcares, la producción o no de azufre, la presencia de enzimas metabólicas (β-galactosidasa, desaminasas, descarboxilasas), etc. Los serotipos de importancia medica y sanitaria pueden distinguirse entre sí por la presencia o ausencia de antígenos en su constitución celular, tales como en ellipopolisacárido (antígeno O), el antígeno flagelar (antígeno H) o el antígeno capsular (antígeno K).

ECOLOGIA.

La mayoría de las especies pueden aislarse del intestino del hombre y de otros animales, de allí su nombre "enterobacteria" (del griego entéron, intestino. Pueden ser flora o ser transitorias en la cavidad bucal, en las regiones húmedas de la piel, en especial el perineo, las fosas nasales y las vías genitales femeninas. Son abundantes en la naturaleza, en particular en medios húmedos y, por ser expulsadas por las heces, funcionan como medidoresepidemiológicos de salubridad e higiene poblacional.

En el intestino, representan una fracción importante de la flora aeróbica, se encuentran en grandes números en el colon(desde el ciego hasta el recto), donde contribuyen a la degradación de residuos alimenticios y a la producción de gas intestinal como parte de la fermentación.

La especie Escherichia coli juega una función importante en el control de otras especies intestinales, constituyendo cerca del 80 por ciento de la flora aeróbica intestinal en una concentración aproximada de 10⁸ en la materia fecal. Otras especies de Enterobacteriaceae con una presencia numerosa intestinal son Proteus y Klebsiella, mientras que otras especies, comoCitrobacter, Hafnia, Providencia y Enterobacter están presentes de manera irregular.

En ciertas oportunidades, los comensales del intestino pueden resultar patogénicos como oportunistas en infecciones urinarias, pulmonía, septicemia o sobreinfecciones, en especial en inmunosuprimidos, en el uso de ciertos antibióticos,desnutrición, etc.

PATOGENIA

La presencia de enterobacterias dentro del organismo es normal, pero puede determinar la aparición de infecciones, cuya gravedad depende principalmente de la capacidad patológica o de la virulencia de la especie en cuestión y de las características del hospedador. Introducidas por los alimentos, provocan problemas intestinales al adherirse y atravesar la barrera de la mucosa gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratación. Ciertas especies provocan patologíasespecíficas:

• La especie Salmonella typhi es responsable de la fiebre tifoidea.
• La especie Shigella dysenteriae es el agente responsable de la disentería bacilar.
• La especie Escherichia coli enterotóxica es responsable de la gastroenteritis infantil.
• La especie Yersinia pestis es responsable de la peste.
• La especie Serratia marcescens usualmente causa infecciones nosocomiales como resultado de tratamiento en unhospital.

Las enterobacterias incluyen a organismos que resultan patógenos para el ser humano como la Escherichia coli o laSalmonella, especialmente importantes en la mortalidad infantil en países en desarrollo³ y patógenos para las plantas comoErwinia, en la mayor parte de los casos causando infecciones oportunistas. Todos los bacilos de Enterobacteriaceae son resistentes a antimicrobianos comunes, tales como la penicilina, la meticilina y la clindamicina, entre otros.

EJEMPLOS...

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  Escherichia coli
 
• 

  Klebsiella pneumoniae
 
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  Salmonella typhimurium
 
• 

  Yersinia pestis

Técnicas de siembra e inoculación.

En medio líquido.

En un tubo inclinado-medio-semilíquido (tubo agar inclinado)

    Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en la ¼ parte de la superficie de la placa; se quema el ansa; se enfría; se gira la placa los 90° y se vuelve a estriar tocando de 3 a  veces el área sombreada inicialmente y cubriendo la otra ¼ parte de la placa y sin quemar el ansa se estría el resto de la superficie.

En un tubo de precipitado estéril, se vierten aproximadamente 2-3 ml del medio de cultivo líquido, siempre debe flamearse la boca del tubo y colocar el algodón. Se incuba a 37°.

Cuando se realice la inoculación, siempre debe ser cerca del mechero. No se deben de tocar las paredes del tubo al sembrar, Si es en caja petri, no importa.

En el caso de la caja petri, al momento de sembrar, se divide imaginariamente al medio en cuatro partes iguales, en el primer cuadrante se esteriliza antes y después de sembrar, en los demás ya no se hace dado que podríamos matar la bacteria.

Inoculación  en biología es ubicar algo que crecerá y se reproducirá, y comúnmente se utiliza esta cabo respecto a la introducción de suero sanguíneo, una vacuna o una sustancia antígeno dentro del cuerpo de un humano o de un animal, especialmente para producir inmunidad a una enfermedad específica. También se puede utilizar este término para referirse a la comunicación (encomendar) de una enfermedad a un organismo vivo por transferencia del agente causal en el organismo, la implantación de microorganismos o material infeccioso a un medio de cultivo como puede ser en la fabricación de cerveza o una placa Petri, o poner microorganismos o virus en el lugar donde la infección es posible.

El verbo inocular proviene del latín inoculare y significa injertar.

Actualmente los términos inoculación , vacunación e inmunización se utilizan aproximadamente como intercambiables. Los microorganismos que se utilizan en la inoculación se llaman inoculando o inóculo .

condiciones de asepsia

El material y los medios de cultivo donde vamos a crecer a los microorganismos deben de ser utilizados en condiciones asépticas para evitar su contaminación con los microorganismos presentes en el medio ambiente.

El mechero Bunsen no sólo permite crear una zona aséptica de trabajo, también nos permite esterilizar diverso instrumental como el asa de siembra o el asa de vidrio, mediante la aplicación directa de calor.

 1. Lavado de manos

2.    Lavado y desinfección de mesas

3.    Crear un campo estéril en área de trabajo

4.    Forrar mesa con papel

5.    Flamear asa (posición perpendicular), procurar hacerlo con la parte alta del mechero

6.    Antes de retirar el asa, flamear la parte metálica y se espera a que se enfríe. NO GOLPEAR EL ASA.

7.    Flamear la boca de los tubos, matraces o frascos.

8.    Después de quitar el algodón, nunca dejarlo sobre la mesa, se toma con el dedo meñique de la mano, siempre trabajando en la proximidad del mechero.

9.    Uso de guantes y cubrebocas (solo el analista)

Esterilización del asa de siembra.

El asa de siembra o asa bacteriológica es probablemente la herramienta más usada por el microbiólogo. Consiste en un filamento con un lazo en uno de sus extremos. El otro extremo está unido a un mango. El filamento suele ser de una aleación metálica que se calienta muy rápidamente. Esta herramienta tan simple nos permite tomar un inóculo de un cultivo bacteriano y transferirlo a otro recipiente con medio de cultivo, o a un portaobjetos para su observación microscópica.

El asa de siembra debe de esterilizarse a la llama antes de usarla y después de haber sido usada. Debe de esterilizarse antes para evitar la contaminación de los microorganismos en estudio con otros microorganismos que estuvieran presentes en el filamento metálico. Debe de esterilizarse después de su uso para evitar que los microorganismos que hemos tomado contaminen el laboratorio o sean incluso un riesgo biosanitario.

Para esterilizar el asa de siembra ponerla lo más vertical posible y acercar el filamento a la llama del mechero Bunsen. Cuando todo el filamento se haya puesto al rojo vivo se habrá conseguido la esterilización. En ese momento retirarla y dejar enfriar antes de tomar la muestra, para evitar que el calor destruya a los microorganismos.

Esterilización del asa de vidrio por flameado con alcohol

El asa de vidrio es utilizada para la extensión de un inóculo por toda la superficie de una placa de agar. El vidrio no puede ser esterilizado mediante la aplicación de calor directo en el mechero Bunsen pues podría fundirse o quebrarse.

Para su esterilización, el asa debe de ser introducida en un bote conteniendo alcohol 96º. Después, escurrirla sacarla y flamearla a la llama del mechero Bunsen. Cuando el alcohol sea consumido el fuego se apagará por si solo. Esperar un poco para enfriar y proceder a usarla.

La esterilización por flameado del alcohol es usada también con otros materiales e instrumentos como pinzas, portaobjetos y cubre objetos, etc.

Precaución: Se recomienda tener mucho cuidado con el bote de alcohol. Conviene trabajar con el bote alejado de la llama del mechero. En caso de que el alcohol se prenda, mantener la calma. El fuego del alcohol se apaga fácilmente si tapamos el bote y dejamos que no haya oxígeno.

Manipulación de la caja

1.    Siempre será en posición invertida (a menos que sea un medio líquido será en posición normal), antes de tomar el inoculo a sembrar.

2.    Se toma de la base de la placa con la mano contraria, a la que sostiene el asa dejando la tapa a lado del mechero

Elaboración de un antibiograma

OBJETIVOS

• Determinar la sensibilidad a diversos antibióticos de un determinado microorganismo
• Comprender el concepto de antibiótico y su especificidad de acción sobre determinadas bacterias.
• Conocer el concepto de cepa sensible y resistente.
• Entender el concepto de halo de inhibición.
• Ser consciente de la importancia de la higiene y el cuidado en la manipulación de materiales biológicos.
• Comprender la importancia de la eliminación de los residuos orgánicos
• Conocer el instrumental de laboratorio necesario en microbiología y los procedimientos para su utilización

MATERIALES

• Jeringa con suero fisiológico estéril (solución de Nacl  al 0,9%)
• Placa “problema” (cultivada en agar-sangre)
• Discos de diferentes tipos de antibióticos (4-6 tipos distintos)
• Tubos de ensayo
• Placa agar-sangre
• Regla milimetrada
• Rotulador de vidrio
• Cinta adhesiva
• Pinzas finas
• Contenedor con lejía
• Torunda estéril
• Tablas para determinación de resistencias

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

Antes de empezar

• No se puede tocar nada que vaya a tomar contacto con la muestra biológica con las manos (depresor, asa de siembre, torunda,...) para evitar contaminaciones.
• Una vez utilizado este material ha de ser eliminado en un contenedor especial. Estos contenedores serán llevados posteriormente a una planta de tratamiento de residuos biológicos, donde serán incinerados.
• Todos los materiales o muestras tomadas deben estar perfectamente identificados: nombre, grupo, fecha e indicativo del tipo de muestra.
• Las placas sembradas deben sellarse con cinta adhesiva al finalizar para evitar su contaminación o la nuestra.
• Al acabar la práctica, se deben lavar bien las manos.

Siembra en césped del microorganismo problema

• Tomamos con una jeringa una pequeña cantidad de suero fisiológico estéril (2-5 ml) y lo vertemos en un tubo de ensayo.
• A partir de la placa problema, que contiene colonias del microorganismo cuya sensibilidad a los antibióticos queremos determinar, tomamos una muestraSUPERFICIAL de UNA SOLA COLONIA con un asa de siembra.
• Introducimos el asa de siembra con la muestra en el tubo y agitamos el asa para realizar una suspensión de las bacterias en el suero fisiológico. Al acabar echamos al contenedor de residuos el asa de siembra.
• Introducimos un hisopo estéril en el tubo, mojar el hisopo estéril en la suspensión. Escurrir el exceso de líquido contra las paredes del tubo de ensayo. Tapar el tubo e inocular la placa pasando muy suavemente por la superficie de la placa agar-sangre nueva. En esta ocasión realizaremos una siembra en césped, es decir, por toda la superficie de la placa, para conseguir que crezca bacterias de modo masivo (no interesa aislar bacterias como en la práctica del frotis faríngeo). Es importante que la siembra sea SUPERFICIAL, sin profundizar en el medio de cultivo.  (se puede Inocular dos veces más en ángulos de 60°)
• Se tapa la placa y se rotula indicando en el nombre, grupo y fecha y marcando con una A la tapa (Antibiograma)

Colocación de los discos de antibiótico

Tomando ahora con las pinzas - NUNCA CON LAS MANOS- un disco de cada uno de los antibióticos que se facilitan (cada disco es un papel de filtro que contiene una suspensión de uno varios antibióticos a la concentracion terapéutica). 

Se deposita el disco suavemente sobre la placa, sin tocar la superficie con las pinzas. es muy importante que el disco contacte con el medio de cultivo en un unico sitio. 

Realizamos la misma operación con los otros cinco antibióticos, colocando los nuevos discos separados de los anteriores, formando un hexágono.

Incubación y observación

Se llevan las placas a incubar a 37°C (temperatura corporal) durante 24 horas. tras este periodo se recogen las placas y SIN ABRIR se observa el crecimiento bacteriano. 

Medición del halo de inhibición

Por la parte trasera de la placa incubada mediremos el diámetro de los halos de inhibición que se han formado alrededor de los discos de antibiótico a los que la bacteria “problema” es sensible.

Anota los datos en la representación de la figura 2, indicando con un número del 1 al 6, el antibiótico colocado en el disco y dibujando la presencia o ausencia de halos y su tamaño en mm.

Con ayuda de las tablas que se te proporcionan determina si la bacteria es sensible (S) o resistente (R) a cada antibiótico y anótaloen la tabla, en las columnas correspondientes.


Resultados 

CONCLUSIONES
Mediante un Antibiograma podemos establecer qué tratamiento será el más adecuado para el paciente afectado por una infección por la bacteria que estemos estudiando.
¿Qué son los halos de inhibición? Alrededor de cada disco de antibiótico, las bacterias sensibles a ese antibiótico no habrán podido reproducirse y, por lo tanto, no forman colonias, dejando un hueco alrededor del disco.
¿Por qué se miden los halos? No basta con ver si las bacterias han crecido o no alrededor del antibiótico para saber si son o no sensibles. Hay que saber “cuánto” no han crecido. Solo si el halo de inhibición es suficientemente grande, usando el antibiótico a la concentración terapéutica –la que el antibiótico puede alcanzar en el lugar de la infección sin que se produzcan efectos tóxicos o secundarios- se dice que la bacteria es sensible al antibiótico. Por eso se mide el efecto y se consultan las tablas.